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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9678 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In einem menschlichen Wirt bilden die bakteriellen Erreger Staphylococcus aureus und Pilze Candida albicans einen gemischten Biofilm, der zu schwerer Mortalität und Morbidität führt. Es fehlen jedoch Untersuchungen zur Bildung und Beseitigung gemischter Biofilme unter dynamischen Bedingungen. Daher wurde in dieser Studie eine mikrofluidische Technik eingesetzt, um die Echtzeitbildung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen (S. aureus und C. albicans) sowie eine nichtinvasive optische Behandlung des etablierten reifen Biofilms mit 405-nm-Laserlicht zu analysieren. Ein Fischgrätenmischer vermischte gründlich sowohl Bakterien- als auch Pilzzellen im Wachstumsmedium, bevor er in die Beobachtungskanäle auf dem Mikrofluidikchip injiziert wurde. Bei einer Durchflussrate von 1,0 µL/min des Wachstumsmediums über 24 Stunden war die bakterielle Biofilmbedeckung bis zu 15 % höher als die des Pilzbiofilms (50 % für Bakterien vs. 35 % für Pilze). Andererseits erzielte der Dual-Spezies-Biofilm aufgrund der kollektiven Interaktion zwischen S. aureus und C. albicans die höchste Abdeckung von ~ 96,5 %. Die Anzahl der Zellproliferationsereignisse bei S. aureus war 12 Stunden lang höher als bei C. albicans, was darauf hindeutet, dass sich der S. aureus-Biofilm schneller entwickelte als bei C. albicans. Die neuartige In-situ-Testplattform zeigte eine signifikante bakterizide Wirkung (80 %) des 405-nm-Laserlichts bei 1080 J/cm2 gegenüber dem etablierten S. aureus-Biofilm, während die gleiche Behandlung etwa 69 % der gemischten Zellen im Dual entfernte -Spezies-Biofilm. Diese Studie ergab, dass die entwickelte mikrofluidische Plattform genutzt werden könnte, um die Bildung von Dual-Spezies-Biofilmen in Echtzeit und laserinduzierte antimikrobielle Wirkungen auf Dual-Spezies-Biofilme zu überwachen.

Mikroorganismen existieren in komplexen Gemeinschaften, einschließlich Wirts-, klinischen und industriellen Umgebungen1,2. Das Vorhandensein komplexer mikrobieller Gemeinschaften ist für eine einzelne oder beide mikrobiellen Arten in der Umwelt von Vorteil3. Darüber hinaus haben polymikrobielle Interaktionen zahlreiche Vorteile, darunter Veränderungen der Immunantwort des Wirts, der mikrobiellen Pathogenese und der Virulenz4. Polymikrobielle Interaktionen in zahlreichen natürlichen Umgebungen, einschließlich des Wirts, führen zur Bildung von Biofilmen, die heterogene Mikrokolonien mikrobieller Zellen enthalten, die von selbst produzierten extrazellulären Polymersubstanzen umgeben sind5. Die mikrobiellen Populationen im Biofilm profitieren einander weitgehend im Hinblick auf den Austausch von Nährstoffen, Metaboliten, Signalmolekülen, genetischen Materialien, die Resistenz gegen antimikrobielle Behandlung und den Schutz vor immunologischen Reaktionen des Wirts6,7,8.

Durch polymikrobielle Biofilme verursachte Infektionen führten zu einer höheren Sterblichkeitsrate (70 %) als durch Monospezies-Biofilme9. Die meisten Informationen über den Prozess der Biofilmbildung und die Virulenzeigenschaften wurden von einer einzigen Bakterienart gesammelt9. Die meisten Empfindlichkeitstests für antimikrobielle Wirkstoffe basieren ausschließlich auf planktonischen Monospezies-Zellkulturen, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Behandlung polymikrobieller Infektionen fehlschlägt10,11. Im aktuellen Kontext ist die Forschung zu polymikrobiellen Biofilmen, bei denen mikrobielle Gemeinschaften aus mehreren Arten zum Einsatz kommen, von erheblichem Interesse, um die tatsächlichen Auswirkungen des polymikrobiellen Biofilms auf den natürlichen Wirt, klinische und industrielle Umgebungen zu bestimmen4. Die Forscher konzentrieren sich auf die Wechselwirkung zwischen Pilzen und Bakterien, um polymikrobielle Wechselwirkungen auf der Ebene verschiedener Königreiche zu verstehen12,13. Pilzpathogene, insbesondere Candida albicans, wurden häufig zusammen mit zahlreichen pathogenen Bakterienarten aus der Mundhöhle, der Haut- und Schleimhautoberfläche, dem Magen-Darm-Trakt, der Lunge und der vulvovaginalen Oberfläche isoliert14,15. Staphylococcus aureus und C. albicans wurden zusammen bei verschiedenen Biofilm-assoziierten Krankheiten identifiziert, darunter Mukoviszidose, Keratitis, beatmungsbedingte Pneumonie, Prothesenstomatitis, Parodontitis, Harnwegsinfektionen und Verbrennungswundeninfektionen, wie von Carolus et al.14 besprochen. S. aureus produziert mehrere Virulenzfaktoren, darunter Proteasen, Hämolysin, Leukocidine, Enterotoxin, immunmodulatorische Moleküle und Peeling-Toxin16. In ähnlicher Weise wies die Pathogenität von C. albicans verschiedene Virulenzfaktoren auf, wie z. B. morphologische Veränderungen, Biofilmentwicklung, Adhäsinproduktion, Freisetzung hydrolytischer Enzyme und Penetration der Wirtszelloberfläche4,17.

Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Interaktion zwischen S. aureus und C. albicans sowohl physikalische als auch chemische Wechselwirkungen umfasst14,18. Das Hyphen-spezifische Rezeptorprotein (Als3p) ist an der physikalischen Interaktion zwischen S. aureus und C. albicans beteiligt, während Quorum Sensing (QS)-Signalmoleküle an der chemischen Interaktion beteiligt sind15. Solche Wechselwirkungen führen zu einer verstärkten Biofilmbildung und der Entwicklung von Resistenzmechanismen gegen antimikrobielle Wirkstoffe19. Darüber hinaus führte die Koinfektion von S. aureus und C. albicans mit dem tierischen Modellorganismus zu einer erhöhten mikrobiellen Belastung in den Wirtsorganen sowie einer signifikanten Sterblichkeitsrate20,21. Bei polymikrobiellen Infektionen teilen sich S. aureus und C. albicans eine gemeinsame Nische im menschlichen Körper, wie Haut, Vagina, Nasengang, Rachen, Bauchhöhle und Mundschleimhaut22. Physikalische Wechselwirkungen werden dadurch hergestellt, dass S. aureus an der Zelloberfläche von C. albicans haftet, während die chemische Wechselwirkung durch die Beteiligung von QS-Signalmolekülen, sekretorischen Chemikalien, die entweder von S. aureus und C. albicans oder vom menschlichen Wirt erzeugt werden, vermittelt wird14,23 . Trotz des Erfolgs der In-vitro-Forschung zur Aufklärung des physikalischen Zusammenspiels zwischen S. aureus und C. albicans sind In-vivo-Studien erforderlich, um den Interaktionsmechanismus in verschiedenen Wirtsgeweben und -organen zu verstehen, die die Hauptursache für synergistische Letalität sind. Darüber hinaus werden durch den Fluss von Körperflüssigkeiten und Sekreten mikrobielle Krankheitserreger, darunter S. aureus und C. albicans, in zahlreichen Körperbereichen menschlicher und tierischer Wirte wie Mund, Lunge, Darm, Magen und Harnwegen freigelegt24. Die meisten polymikrobiellen In-vitro-Wechselwirkungen und die Bildung von Dual-Spezies-Biofilmen zwischen S. aureus und C. albicans wurden unter statischen Bedingungen untersucht. Es fehlen jedoch Untersuchungen zur Bildung polymikrobieller Biofilme unter dynamischen Bedingungen.

Kürzlich wurde die integrierte Mikrofluidik als vielversprechender Ansatz zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen identifiziert25. Mehrere andere wichtige Phänomene wurden ebenfalls untersucht, darunter die Einflüsse physikalischer und chemischer Faktoren auf die Lebensfähigkeit, Proliferation, Funktionalität und Motilität der Zellen10,26. Darüber hinaus kann das Mikrofluidiksystem dabei helfen, die Auswirkungen hydrodynamischer Faktoren wie Strömungsgeschwindigkeit und Scherkräfte auf das Anfangsstadium der Biofilmentwicklung und Zellmorphologie zu verstehen26. Crabbé et al. waren sich einig, dass Scherkräfte die mikrobielle Adhäsion, Persistenz und damit die Infektionsfähigkeit opportunistischer Krankheitserreger beeinflussen27. Vor diesem Hintergrund haben mehrere Berichte den Einsatz von Mikrofluidik zur Untersuchung der Biofilmbildung auf der Ebene einer einzelnen Spezies, zum Testen des Einflusses hydrodynamischer Bedingungen, zur bakteriellen Chemotaxis und zum Screening von Antibiotika oder Antibiofilm-Medikamenten gezeigt26,28. In ähnlicher Weise untersuchten andere Studien die Echtzeitüberwachung der Biofilmbildung auf der Ebene einzelner Arten29,30,31,32. Darüber hinaus wurde das Mikrofluidiksystem zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen verwendet33. Obwohl die Bildung von Multi-Spezies-Biofilmen mithilfe eines mikrofluidischen Geräts34, beispielsweise in Zahnbelag, durchgeführt wurde, haben relativ wenige Studien die Echtzeitüberwachung der Biofilmproduktion auf Multi-Spezies-Ebene untersucht35,36. Die Implementierung der mikrofluidischen Methode kann bei der Überwachung der Mono- und Dual-Spezies-Biofilmbildung zwischen S. aureus und C. albicans in Echtzeit helfen. Darüber hinaus wurde eine optische Behandlung der bakteriellen Biofilme mit 405-nm-Laserlicht weithin eingesetzt, um die antibakterielle Wirkung auf bakterielle Biofilme in vitro zu bewerten37; Es fehlt jedoch an Forschung zum 405-nm-Laserlicht zur Beseitigung von Biofilmen bei zwei Arten mithilfe der Mikrofluidikplattform unter hydrodynamischen Bedingungen. Daher zielte die aktuelle Studie darauf ab, eine vielseitige und dennoch einfache mikrofluidische Plattform zu entwickeln, um die Bildung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen von S. aureus und C. albicans in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus wurde ein physikalischer Ansatz, die Photobestrahlung mit 405-nm-Laserlicht, verwendet, um die entwickelten reifen Mono- und Dual-Spezies-Biofilme von S. aureus und C. albicans unter hydrodynamischen Bedingungen zu beseitigen.

Abbildung 1 zeigt Bilder des entworfenen Chips sowie die Korrelation zwischen dem Farbmischeffekt und der durch den Fischgrätenmischer erzeugten Biofilmbildung. Der mikrofluidische Kanal wurde auf eine Breite von 100 µm und eine Höhe von 180 µm ausgelegt (Abb. 1a). Dadurch ermöglichte der Chip den Forschern die Untersuchung von Adhäsion, Proliferation und Diffusion auf Einzelzellebene während der Biofilmentwicklung. Der Mischeffekt der beiden Farben (Gelb und Blau) vor und nach dem Fischgrätenmischer ist in Abb. 1b dargestellt. Vor dem Mischen waren zweifarbige Bereiche sichtbar (oben), während die grünähnliche Farbe durch das gute Mischen entstand (unten). Dieser Effekt ist in Abb. 1c dargestellt. Bei nicht mischendem Einsatz veränderten sich Grauwert und Kanalbreite deutlich. Im Gegensatz dazu blieb der Grauwert über die untersuchte Breite des beobachteten Kanals nahezu konstant. Dadurch konnte während der Injektionsphase die Mischfähigkeit des vorgeschlagenen Chips mit zwei Mikroorganismen am Einlass und am beobachteten Kanal deutlich unterschieden werden. Im Einlasskanal wurden zwei offensichtliche Bereiche mit Bakterien und Pilzen identifiziert. Bemerkenswerterweise wurde nach dem Fischgrätenmischen eine Mischkultur beobachtet (Abb. 1d).

Visualisierungs- und Mischfähigkeit von mikrofluidischen Kanälen: (a) Übersicht über den vorgeschlagenen mikrofluidischen Chip (oben) und Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Bilder von Fischgräten- (unten links) und beobachteten (unten rechts) Kanälen (IC-Einlasskanal, HC-Fischgrätenkanal). , OC beobachteter Kanal; Maßstabsbalken in (a) = 100 µm), (b) Farbmischeffekt vor (oben) und nach (unten) dem Fischgrätenmischer (Maßstabsbalken in (b) = 100 µm), (c) Grau Wert gemessen aus blauen Linien auf Farbmischbildern (b) vor und nach dem Fischgrätenmischer und (d) Bakterien- und Pilzmischungen vor und nach dem Fischgrätenmischer in der Injektionsphase (Maßstab in (d) = 10 µm). Die obere Linie stellt Einlasskanäle mit zwei scheinbaren Farbbereichen (blau und gelb) dar, die dann gründlich in einen grünen Farbbereich auf dem beobachteten Kanal gemischt wurden.

Abbildung 2a zeigt eine optische Simulation eines Laserstrahls, der sich durch ein optisches System ausbreitet. Der divergierende Ausgangsstrahl (Gaußsche Verteilung und numerische Apertur = 0,22) vom Lasersystem wurde gleichmäßig kollimiert und an drei Kanäle mit gleichen Strahlflecken von 5 mm abgegeben (Abb. 2b; links und Mitte). Die drei Leistungsstufen auf diesen Kanälen betrugen 50, 25 bzw. 12,5 % der Ausgangsleistung des Lasersystems. Die experimentellen Ergebnisse sind in Abb. 2c dargestellt, um die Simulation zu validieren. Die Lichtemissionen der drei Flat-Top-Strahlen auf der Chipoberfläche zeigten, dass der Gaußsche Strahl der Laserquelle in gleichmäßige Punkte auf der Kanaloberfläche diffundierte. Die Intensitäten betrugen jeweils 50, 100 und 150 für jede Einheit (Abb. 2d).

Optischer Systemaufbau für die Biofilmbehandlung: (a) optischer Modellaufbau für die Simulation, (b) simulierte Strahlpunkte, die vom Laserausgang (links) und auf drei beobachteten Kanälen (rechts) emittiert werden, (c) gemessene Laserstrahlpunkte auf den drei beobachteten Kanäle im vorgeschlagenen Mikrofluidik-Chip und (d) Lichtintensität, quantifiziert aus den drei Laserstrahlpunkten auf den drei beobachteten Kanälen (LS-Laserquelle, optische Detektoren D1 und D2, Linsen L1 und L2, optischer OD-Diffusor, BS1, BS2 und BS3-Strahlteiler, PM-Leistungsmesser, CN1, CN2 und CN3 beobachteten Kanäle von 1 bis 3 auf dem Mikrofluidikchip; Maßstabsbalken = 3 mm).

Abbildung 3 vergleicht die Biofilmabdeckungen der Monospezies-Biofilmbildung in Mikrofluidikkanälen bei verschiedenen Flussraten mit dem Biofilm, der unter statischen Bedingungen in Mikrotiterplatten gewachsen ist. Während des Experiments war die Häufigkeit der Adhäsion von S. aureus-Zellen höher als die von C. albicans-Zellen. Die Mikroorganismen hefteten sich nicht nur an den Boden der Kanäle, sondern auch untereinander und bildeten sehr große Aggregate. Darüber hinaus wurde nach der Inokulum-Injektion in die Mikrofluidikkanäle eine Streamer-Bildung beobachtet. Der Streamer entfernt regelmäßig die neu anhaftenden Mikroorganismen auf der Glasoberfläche. Aus diesem Grund haben wir in dieser Studie einen Fischgrätenmischer in den Mikrofluidikkanal integriert. Der Strom der injizierten Mikroorganismen wurde gründlich gemischt, bevor er durch die beobachteten Kanäle strömte. Darüber hinaus wurde der Kanal an den Einlässen konisch konstruiert, um die Biofilmbildung bei unterschiedlichen Durchflussraten in einem Kanal zu analysieren (Abb. 1b). Die mikrobielle Dichte nahm mit zunehmendem Abstand von den Einlässen aufgrund der zunehmenden Strömungsgeschwindigkeit ab. Drei Kanäle wurden über einen bestimmten Zeitraum mit drei unterschiedlichen Durchflussraten gepumpt. Zum Zeitpunkt der Adhäsion und Proliferation können beide Mikroorganismen hohe Flussraten erfahren (Flussrate = 1,5 µL/min; Flussgeschwindigkeit = 25 mm/min). Da die Schergeschwindigkeit 50 s−1 betrug und die Reynolds-Zahl 5,1 (Re < 100) betrug, wurde die Mediumströmung als laminar angesehen.

Vergleich der Biofilmbedeckungen der Monospezies-Biofilmbildung bei verschiedenen Flussraten (0,5, 1,0 und 1,5 µL/min) in Mikrofluidikkanälen mit statischen Bedingungen, die nach 24-stündiger Kultur auf Wellplatten gezüchtet wurden. (a,c) S. aureus-Biofilm unter hydrodynamischen Bedingungen. (b,d) C. albicans-Biofilm unter hydrodynamischen Bedingungen. (e,f) Biofilme einzelner Arten (S. aureus vs. C. albicans) unter statischen Bedingungen (blaue Pfeile = extrazelluläre Matrix; rote Pfeile = Pseudohyphengruppen; gelbe Pfeile = Knospungsbildung). Die Cyan-Linien stellen die vorgegebene Biofilmabdeckung (~ 50 %) im FOV auf Mikrokanälen dar. Blaue und rote Balkendiagramme in (e,f) zeigen das Biofilmwachstum von S. aureus und C. albicans in vitro auf 96-Well-Platten, gemessen anhand der optischen Dichte bei 570 nm.

Nach 12 Stunden Kultur mit 1,5 µL/mm deckte S. aureus nur 7 % des Sichtfelds (FOV) ab, während C. albicans sich zunehmend anheftete und ausdehnte, um 16 % des Sichtfelds abzudecken. Andererseits wurden S. aureus-Bakterien nach 12 Stunden Anheftung aktiviert und reiften nach 24 Stunden schnell zu einem signifikanten Biofilm heran (Biofilmabdeckung von 28,7 %). Wie in Abb. 3c, d (unten) gezeigt, produzierten sowohl S. aureus als auch C. albicans kaum dichte Biofilme. Allerdings vibrierte der fast nicht anhaftende S. aureus bei 0,5 µL/mm nur entlang der Seitenwände um sich selbst und planktonische Bakterien strömten langsam durch die Mikrofluidikkanäle. Aufgrund des Flusses von nicht anhaftendem planktonischem S. aureus wurde die Bewegung einzelner Zellen selten festgestellt. Nach 24 Stunden Kultur beobachteten wir jedoch einen überwucherten Biofilm mit planktonischen Bakterien (80,2 % des Sichtfelds). In ähnlicher Weise entwickelte sich der C. albicans-Biofilm 16 Stunden lang mäßig, bevor er sich über weitere 8 Stunden schnell vermehrte (62,5 % des Sichtfelds; Abb. 3d; oben). Anschließend wurden 1,0 µL/min verwendet, um sowohl S. aureus- als auch C. albicans-Biofilme zu züchten, wobei der mikrobielle Biofilm etwa 50 % des FOV abdeckte. Unter dieser hydrodynamischen Bedingung waren nur anhaftende Mikroorganismen sichtbar, während nicht anhaftende Mikroorganismen durch mittlere Bewegung eliminiert wurden.

S. aureus und C. albicans produzierten Biofilme mit einer Bedeckung von 49,5 % bzw. 35,1 %. Abbildung 3c,d zeigt die qualitativen Beobachtungen (Mitte). Die extrazelluläre Matrix (ECM) der S. aureus-Biofilme variierte, wohingegen die C. albicans-Biofilme das Aussehen von Hefe, Knospungsentwicklung und scheinbare Pseudohyphen aufwiesen. Unter statischen Bedingungen entsprachen die morphologischen Typen der beiden mikrobiellen Biofilme der niedrigen Flussrate dynamischer Bedingungen (0,5 µL/min). Der S. aureus-Biofilm wies eine stärker ausgedehnte Biofilmarchitektur auf, wohingegen der C. albicans-Biofilm sehr große lokale Aggregate aufwies (Abb. 3e, f). In guter Übereinstimmung mit den REM-Bildern betrugen die gemessenen optischen Dichten der auf 96-Well-Platten gewachsenen S. aureus- und C. albicans-Biofilme 1,0 bzw. 0,7.

Abbildung 4 zeigt eine Einzelzell-Tracking-Untersuchung der frühen Biofilmentwicklung anhand von Zeitraffer-Mikroskopiebildern von S. aureus und C. albicans. Ein Proliferationsereignis wurde als die Bildung neuer Mikroben definiert, während ein Freisetzungsereignis als die Trennung eines Mikroben von seinen Mutterzellen oder als Flucht vom vorherigen Standort definiert wurde. Wir konnten die Biofilmentwicklung verschiedener Mikroorganismen unter ähnlichen hydrodynamischen und Umweltbedingungen in einem Experiment analysieren, indem wir drei separate Kanäle auf einem Chip entworfen haben. C. albicans besiedelte sehr schnell die Bodenoberfläche (Abb. 4a; links). Nach 12-stündiger Inkubation wurde ein reifer C. albicans-Biofilm beobachtet. Andererseits wurde S. aureus angeheftet, vermehrt und in der Umgebung verbreitet. Darüber hinaus war die Anzahl der am Glasboden haftenden S. aureus-Zellen größer als die der C. albicans-Zellen. Nach 4 Stunden Kultur beobachteten wir ein fortschreitendes Wachstum und keine Entladung von C. albicans-Zellen (Abb. 4b; unten). Nach 30-minütiger Anhaftung wurde eine neue Knospungsentwicklung beobachtet. Nach dieser Zeit begannen sich C. albicans-Zellen mäßig freizusetzen. Allerdings war die Anzahl der beobachteten Vermehrungsereignisse bei der Inkubation von C. albicans größer als die Anzahl der Freisetzungsfälle. Infolgedessen wuchs der Biofilm nach 12 Stunden Inkubation allmählich und reifte. Trotz der hohen Anzahl an Freisetzungsereignissen zeigte S. aureus nach 2-stündiger Inkubation eine schnelle Adhäsion (Abb. 4b; oben). S. aureus-Bakterien teilten sich zu Beginn der Inkubation aktiv. Auf dem Boden befanden sich mehr S. ​​aureus-Zellen als C. albicans. Trotz dieses Verhaltens setzte S. aureus seine Freisetzung und Vermehrung zwischen 3 und 6 Stunden fort, was die Verzögerung bei der bakteriellen Besiedlung durch S. aureus erklärt. Nach 6 Stunden Kultur vermehrten sich die S. aureus-Zellen deutlich und bildeten nach 12 Stunden Kulturinjektion einen starken Biofilm. Diese Ereignisse wurden in den C. albicans-Zellen nicht beobachtet. Abbildung 4c zeigt die Reproduktion von C. albicans-Zellen. Nach etwa 30 Minuten Injektion bildete sich zunächst ein Knospungsmuster, und der Mutterkern im Inneren des Pilzes wurde in zwei Teile geteilt. Der Tochterkern bewegte sich dann zum Knospungsmuster. Schließlich trennte sich die Tochterhefe von der Mutterhefe und verursachte eine knospende Narbe auf der Zelloberfläche.

Einzelzell-Tracking-Analyse der frühen Biofilmbildung: (a) Zeitraffer-Mikroskopiebilder (links = S. aureus; rechts = C. albicans), (b) Anzahl der Ereignisse während 12 Stunden Kultur (oben = Visualisierung der Freisetzung). und Proliferationsereignisse; Mitte = Anzahl der Ereignisse/FOV aus dem Wachstum von S. aureus; unten = Anzahl der Ereignisse/FOV aus dem Wachstum von C. albicans) und (c) Knospungsbildung von C. albicans-Zellen nach 0, 30 und 60 Minuten (Maßstabsbalken = 20 µm). Der gelbe Pfeil zeigt den Zellkern in den Zellen von C. albicans.

Abbildung 5 veranschaulicht die räumliche Morphologie und die physikalischen Wechselwirkungen der Bildung von Biofilmen zweier Arten durch S. aureus und C. albicans. Das Hellfeldbild in Abb. 5a zeigt, dass S. aureus nicht nur auf der Bodenoberfläche, sondern auch auf den Zelloberflächen von C. albicans Kolonien entwickelte. Unter hydrodynamischen Bedingungen wurden S. aureus-Bakterien durch den Flüssigkeitsfluss beeinträchtigt und nicht anhaftende Bakterien wurden in Richtung der Auslässe gespült. Allerdings fungiert die Zelloberfläche von C. albicans (Hefe- und Pseudohyphal-Formen) als Gerüst und fördert die Adhäsion von S. aureus-Zellen. Abbildung 5a zeigt auch verschiedene Formen von C. albicans-Krankheitserregern, wie Hefe, Knospungsform und Pseudohyphengruppen, die zu einer erhöhten Resistenz gegen antimykotische Germizide führen. Im Allgemeinen zeigten die dualen Biofilme im Laufe der Zeit ein evolutives Verhalten hinsichtlich der Anzahl der Zellen, der Stoffwechselaktivität und der Gesamtbiomasse. Das Fluoreszenzbild in Abb. 5b bestätigt die Architektur des dualen Biofilms. Zwei Zellen interagierten miteinander und bildeten einen verdichteten Biofilm. S. aureus folgte der C. albicans-Formation; Daher wurde weit entfernt von den Standorten von C. albicans ein sehr kleiner S. aureus-Biofilm beobachtet. Abbildung 5c ​​zeigt die Tendenz des dualen Biofilmwachstums über 24 Stunden Inkubation. Innerhalb von 4 Stunden nach der ersten Inkubation waren die Anzahl der Freisetzungen und die Vermehrung der beiden Krankheitserreger identisch. Somit betrug die Biofilmabdeckung etwa 20 % des FOV. Der Dual-Spezies-Biofilm entwickelte sich zwischen 6 und 12 Stunden deutlich. Zwölf Stunden später scheint sich die gemischte Biofilmbildung aufgrund der stationären Phase jedoch langsam entwickelt zu haben und deckt nach 24 Stunden Inkubationszeit 96,5 % des FOV ab. Wenn das Objektiv des inversen Mikroskops auf und ab bewegt wurde, war in der Richtung senkrecht zur Bodenoberfläche deutlich ein dickerer Biofilm zu erkennen. Zum Vergleich mit den statischen Bedingungen wurde der Dual-Spezies-Biofilm auch auf 96-Well-Mikrotiterplatten inkubiert. Im Gegensatz dazu hafteten die beiden Mikroorganismen gleichmäßig an und vermehrten sich auf der inkubierten Oberfläche (Abb. 5d). Bemerkenswert ist, dass C. albicans-Krankheitserreger in verschiedenen Phasen wuchsen, einschließlich Hefe, Knospenbildung und Pseudohyphen.

Biofilmbedeckung der Biofilmbildung bei zwei Arten (S. aureus + C. albicans): (a) Hellfeldbild, (b) Fluoreszenzbild mit SYTO-9-Farbstoff, (c) zeitliche Entwicklung der Biofilmbedeckung bei einer Durchflussrate von 1 μL/min und (d) SEM-Bild unter statischen Bedingungen (Maßstabsbalken = 20 μm).

Abbildung 6 zeigt die optimale Laserdosis für eine erfolgreiche Biofilm-Beseitigung. Der separate Biofilm auf jedem Kanal wurde aufgrund der Weiterentwicklung der Verwendung von drei Kanälen in einem Chip und der Integration der optischen Systemversorgung mit drei optischen Pfaden (50 %, 25 % und 12,5 % des Ausgangslasers) mit der vorgegebenen optischen Energie bestrahlt Leistung). Nach 90 Minuten Laserlichtbestrahlung betrug die Vitalität der S. aureus-Biofilme 71,1 %, 46,5 % bzw. 19,8 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Abb. 6c; p < 0,01).

Laserbehandlung des Monospezies-Biofilms von S. aureus und C. albicans für 90 Minuten bei verschiedenen Bestrahlungsstärken: (a) unbehandelte Kontrolle (oben) und behandelte Proben (unten) des S. aureus-Biofilms, (b) unbehandelte Kontrolle ( oben) und behandelte Proben (unten) von C. albicans-Biofilm, der auf Kanal 1 gewachsen ist, und (c) Vergleich der gemessenen Fluoreszenzintensitäten (Fluenzen auf den Kanälen 1, 2 und 3 = 1080, 540 bzw. 270 J/cm2; Maßstabsbalken = 20 μm; mit C-Sa unbehandelte Kontrollproben von S. aureus-Biofilm, mit 1-Sa, 2-Sa, 3-Sa behandelte Proben von S. aureus auf den Kanälen 1, 2 bzw. 3, mit C-Ca unbehandelt Kontrollproben von C. albicans-Biofilm, mit 1-Ca, 2-Ca, 3-Ca behandelte Proben von C. albicans auf den Kanälen 1, 2 bzw. 3; ***p < 0,01 vs. unbehandelte Kontrolle; N = 5 ).

Andererseits waren Biofilme von C. albicans mit einer Zelllebensfähigkeit von 86,2 %, 69,7 % bzw. 26,4 % resistenter gegen Laserlicht als unbehandelte Kontrollen (Abb. 6c; p < 0,01). Anschließend wurde die maximale Laserlichtbestrahlungsstärke für zwei separate Biofilmbehandlungen zum Vergleich mit der Reinigungswirksamkeit des Dual-Spezies-Biofilms ausgewählt. Abbildung 7 zeigt die Wirksamkeit der Lasertherapie der Dual-Spezies-Biofilme von S. aureus und C. albicans bei einer Flussrate von 1 µL/min. Die unbehandelte Kontrollprobe war vollständig grün, was darauf hindeutet, dass alle Zellen lebten. Andererseits nahm die Grünintensität mit der Zeit stetig ab (Abb. 7a – d). Die Zelllebensfähigkeit wurde nach 90-minütiger Laserlichtexposition mit 31,5 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen bestimmt (Abb. 7e; p < 0,01).

Laserbehandlung des Dual-Spezies-Biofilms (S. aureus + C. albicans) bei einer Flussrate von 1 µL/min: (a–d) Zeitrafferbilder der Proben nach Behandlungen für 0, 30, 60 und 90 min bzw. (e) Grünintensitäten gemessen an der unbehandelten Kontrolle (0 min) und den behandelten Proben (CTRL: unbehandelte Kontrolle; Maßstabsbalken = 20 μm; ***p < 0,01 vs. unbehandelte Kontrolle; N = 5).

Diese Studie ist aufgrund der Echtzeitverfolgung der Bildung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen von S. aureus und C. albicans auf Einzelzellebene von Bedeutung, gefolgt von der Entwicklung eines antimikrobiellen Therapieansatzes. Die Bakterienanhaftung war auf dem Mikrokanalboden räumlich kontrolliert und homogen. In dieser Studie haben wir ein Mikrofluidiksystem für Echtzeitstudien zur Anhaftung von Bakterien-/Pilzarten auf Oberflächen und zur Biofilmbildung in einem Mikrokanal unter gut kontrollierten Bedingungen entworfen und entwickelt. Tehranirokh et al. berichteten, dass die zuvor beschriebene Mikrokanalgröße eine feine Kontrolle der hydrodynamischen Umgebungen ermöglichte, um Zell-Zell- und Zell-ECM-Wechselwirkungen zu untersuchen38. Darüber hinaus umfasste die aktuelle Forschung die Kultivierung, die es ermöglichte, Biofilme von Pilz- und Bakterienzellen entweder einzeln oder in gemischter Form unter Verwendung ihrer jeweiligen Wachstumsmedien oder gleichermaßen gemischter Kulturmedien zu etablieren. Daher muss die Zellkultur der beiden Mikrobenarten vollständig gemischt werden, bevor sie in die beobachteten Kanäle auf dem Mikrofluidikchip eingeimpft wird. Bei diesem passiven Fischgräten-Mischansatz wurden Querströmungen eingesetzt, um Mikrowirbel in Mikrofluidkanälen zu erzeugen38. Der Zweck dieser innovativen Mischtechnik bestand darin, die Konzentrationen der einzelnen Zellkulturen in der anfänglichen Mischphase zu kontrollieren und den gesamten Interaktionsprozess während der Bildung von biofilmübergreifenden Biofilmen zu untersuchen. Infolgedessen wurden alle Mikroorganismen und Wachstumsmedien während der Etablierung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen gründlich vermischt. Darüber hinaus wurden aufgrund der drei unabhängigen Kanaldesigns des Mikrofluidikgeräts drei unterschiedliche phänotypische Architekturen von Bakterien, Pilzen und ihren gemischten Biofilmen gleichzeitig in einem Chip analysiert. Dadurch kann das Experiment dreimal schneller abgeschlossen werden als mit einem einzigen Kanal auf einem Chip. Der vorgeschlagene Aufbau entstand aus der langen Zeit der konventionellen Biofilmkultur (Kultivierungszeit > 24 Stunden)39.

Unter Verwendung eines etablierten Mikrofluidikgeräts zeigten die aktuellen Ergebnisse, dass mehr anhaftende Pilzzellen in der Injektionsphase im Vergleich zum bakteriellen Biofilm nicht zu einer größeren Oberflächenbesiedlung und Biofilmentwicklung führten. Dies wurde auf eine höhere Wachstumsneigung der Bakterien in einer kurzen Inkubationszeit zurückgeführt. Bei dieser Untersuchung blieben die Mikroben zwei Stunden lang an der Kanaloberfläche haften, was mit den vorherigen Studien übereinstimmt40. Wang et al. bestätigte, dass Bakterien anhafteten, sich aber nicht vermehrten, da in den ersten zwei Stunden einzelne E. coli-Bakterien auf den Oberflächen entdeckt wurden. Dieses Phänomen ist als Verzögerungsphase der Bakterienwachstumskurve40 bekannt. Die Bakterienadhäsion und die Biofilmentwicklung werden durch experimentelle Bedingungen (z. B. Wachstumsmedien und Eigenschaften der Materialoberfläche) und die Art der Bakterienarten beeinflusst41,42.

Allerdings vibrierten in dieser Studie bei einer Flussrate von 0,5 µL/mm im Kanal fast nicht anhaftende (planktonische) S. aureus-Zellen entlang der Seitenwände und flossen langsam durch die mikrofluidischen Kanäle. Aufgrund der zufälligen Bewegung planktonischer Bakterienzellen ist es schwierig, Bilder aufzunehmen, was letztendlich zu einer fehlerhaften Schätzung der Bedeckung des einfachen Biofilms führte. In-vitro-Studien unter statischen Bedingungen litten auch unter Planktonzellen, die die Quantifizierung und Weiterverarbeitung des Biofilms beeinträchtigten43. Mit Hilfe des neu entwickelten Mikrofluidikgeräts konnten die hydrodynamischen Bedingungen für die Einzelzelluntersuchung gut kontrolliert werden. Infolgedessen ermöglichte die in dieser Studie entwickelte Mikrofluidik-Technologie die automatisierte Einzelzellverfolgung und den Einfluss hydrodynamischer Bedingungen während des Wachstums und der Biofilmbildung in den feinen Kanälen. Das Mikrofluidikgerät war auch mit Laserbestrahlung ausgestattet, was bei der Echtzeitbehandlung mikrobieller Zellen bei unterschiedlichen Flussraten half. S. aureus-Bakterienzellen vermehrten und diffundierten schneller als C. albicans-Zellen, was zu einer sich stärker ausbreitenden reifen Biofilmarchitektur von S. aureus führte. Die Knospungsbildung in C. albicans-Zellen wurde offenbar bei der Migration des Zellkerns von den „Mutter“-Zellen zu den „Tochter“-Zellen beobachtet. Nach etwa 30-minütiger Injektion bildete sich ein Knospungsmuster heraus und der Mutterkern innerhalb der Pilzzellen wurde in zwei Teile gespalten. Die Tochterkerne wurden dann in Knospen übertragen. Schließlich trennt sich die Tochterhefe von der Mutterhefe und bildet eine knospende Narbe auf der Zelloberfläche44. Darüber hinaus hafteten S. aureus-Bakterien am Kanalboden und an der Oberfläche von C. albicans-Pilzzellen und bildeten einen biofilmübergreifenden Biofilm. Berichte zeigten, dass die Oberfläche der C. albicans-Zellen (Hefe- und Pseudohyphal-Formen) als Gerüst fungierte, um die Anhaftung von S. aureus an die C. albicans-Zellen im Prozess der Bildung eines biofilmübergreifenden Biofilms zu fördern18,45. So beobachteten wir eine kollektive Entwicklung des gemischten Biofilms mit einer FOV-Abdeckung von 96,5 % für 24 Stunden Inokulation bei einer Flussrate von 1 µL/min, was fast doppelt so schnell im Vergleich zum S. aureus-Biofilm und dreimal schneller im Vergleich zum S. aureus-Biofilm war zur Bildung von C. albicans-Biofilmen.

Gemäß dem vorgeschlagenen Modell eignet sich eine mikrofluidische Plattform für die Analyse der Wirkung von Wachstumsfaktoren, wie z. B. Scherspannung, auf die oben genannten Phänomene auf verschiedene mikrobielle Spezies sowie für die Stabilität und Anpassungsfähigkeit der Plattform zum Testen neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe. Im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika-Empfindlichkeitstests kann beispielsweise ihre Wirksamkeit auf oberflächenhaftende Bakterien in einer therapeutisch relevanteren Umgebung beurteilt werden. Darüber hinaus würde eine Echtzeitüberwachung der antimikrobiellen Aktivität der Laserbehandlung bei einer Wellenlänge von 405 nm auf Einzelzellebene ein besseres Verständnis ihrer Wirkungsweise ermöglichen. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Gaußschen und unkollimierten Strahlprofilen der Laserquelle wurde der Laserstrahl auf den Mikrokanaloberflächen in flache und kollimierte Formen umgewandelt (Abb. 2). Daher verkürzte die Vielseitigkeit des Aufbaus des optischen Systems die Zeit und ermöglichte eine präzisere Messung der Biofilmvernichtung. Nach 90-minütiger Laserlichtbestrahlung betrug die Vitalität der S. aureus- und C. albicans-Biofilme 19,8 % bzw. 26,4 %, wie durch Messung der Intensität nachgewiesen wurde (Abb. 6c; p < 0,01). Im Gegensatz dazu haben Peters et al. zeigten, dass die 4-stündige Inkubation von C. albicans in 30 % Ethanol (EtOH) ausreichte, um das Wachstum abzutöten und zu begrenzen, wohingegen 50 % EtOH erforderlich waren, um das Nachwachsen von S. aureus zu blockieren46. Mit anderen Worten: Die Biofilme von C. albicans waren anfälliger für EtOH als die Biofilme von S. aureus. Im Fall des gemischten Biofilms wurde nach 90-minütiger Laserlichtbestrahlung eine Zelllebensfähigkeit von 31,5 % ermittelt (Abb. 7e), was darauf hindeutet, dass der gemischte Biofilm resistenter gegen Laserbestrahlung war als die Monospezies-Biofilme. Lara et al. berichteten außerdem, dass gemischte Bakterien-Pilz-Biofilminfektionen aufgrund des ECM-Schutzes durch Pilze schwieriger zu behandeln sind als Monospezies-Biofilminfektionen, was auf eine höhere Sterblichkeitsrate und höhere Gesundheitskosten hindeutet47. Laut Zago et al. hatte die Koexistenz von S. aureus und C. albicans im Biofilm-Entwicklungsmodus offenbar kollektive Auswirkungen, wobei Bakterienzellen bevorzugt mit Hyphenformen der Pilzzellen assoziiert waren48. Lin et al. schlugen einen plausiblen Mechanismus für den gemischten Biofilm vor, indem sie planktonische Formen der beiden Bakterien annahmen, die in Suspension interagieren könnten49. Die Koaggregation kann dazu beitragen, dass C. albicans an Masse gewinnt und auf den Kanalboden absinkt49. Diese Affinität von S. aureus zu C. albicans-Hyphen könnte eine entscheidende Rolle bei der erhöhten Virulenz der Infektion spielen, die durch diesen gemischten Pilz-Bakterien-Biofilm aufrechterhalten wird.

Diese Studie unterliegt einer inhärenten Einschränkung aufgrund der Verwendung nur zweidimensionaler Bilder mit einem inversen Mikroskop, die durch den Einsatz konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie mit Z-Achsen-Bildgebung überwunden werden könnte51. Weitere Studien sind erforderlich, um hochauflösende Bilder der polymikrobiellen Interaktion unter Verwendung eines modifizierten Mikrobenstamms mit einem fluoreszierenden Proteinkonstrukt zu erhalten. Da die vorgeschlagene Plattform außerdem die Untersuchung eines breiten Spektrums von Mikroorganismen und Wachstumsbedingungen ermöglicht, werden in Zukunft Studien zur Bildung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen durchgeführt, die in einem modifizierten synthetischen Medium gezüchtet werden, das biologische Flüssigkeiten und Sekrete nachahmt . Schließlich wird die weitere Forschung weiterhin den molekularen Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen zwei Spezies im Hinblick auf chemische Echtzeitmessungen (z. B. pH und O2), die Bestimmung der Verteilung der EPS-Komponenten, die Messung mikrobieller Sekundärmetaboliten, den Nährstoffmangel und morphologische Veränderungen untersuchen durch den Einsatz fortschrittlicher Mikrosensoren, Mikroskopie, Metabolomik und Proteomik52,53,54,55,56,57. Darüber hinaus wird die mit Biofilm und Virulenz verbundene Genexpression untersucht, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen58,59. Der manipulierte Mikrobenstamm mit dem fluoreszierenden Proteinkonstrukt wird zur Überwachung der hochauflösenden Bildgebung der polymikrobiellen Interaktion verwendet.

Diese Studie zeigt eine innovative mikrofluidische Plattform zur Überwachung der Bildung und Beseitigung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen bakterieller (S. aureus) und pilzlicher (C. albicans) Krankheitserreger in Echtzeit. Im Gegensatz zu statischen Bedingungen wurde die physikalische Interaktion zwischen S. aureus und C. albicans zur Bildung eines Dual-Spezies-Biofilms unter verschiedenen hydrodynamischen Bedingungen untersucht. Mit der vorgeschlagenen Methode kann die antimikrobielle Wirksamkeit des 405-nm-Laserlichts auf den etablierten reifen Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen von S. aureus und C. albicans sichtbar gemacht werden. Weitere Studien werden die Wirkung der mikrofluidischen Umgebung auf die sekretorischen Moleküle analysieren, die von Bakterien- oder Pilzarten während der Biofilmentwicklung produziert werden. Die entwickelte Plattform wird verwendet, um die antimikrobielle Therapie in situ gegen oberflächenassoziierte biofilmbildende mikrobielle Krankheitserreger zu untersuchen.

Der Bakterienstamm S. aureus (KCTC 1916) wurde von der Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea) bezogen, während der Pilzstamm C. albicans (KCCM 11282) vom Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM; Seodaemun-gu, Seoul, Südkorea). Die Wachstumsmedien für die Kultivierung von S. aureus und C. albicans waren tryptische Sojabrühe (TSB; Difco Laboratory Inc., Detroit, MI, USA) und Kartoffel-Dextrose-Brühe, ergänzt mit 5 % Glucose. Die mikrobiellen Kulturen wurden in ihren Wachstumsmedien für Monospezies-Biofilme gezüchtet, während für das Wachstum von Mischbiofilmen Mischkultur-Wachstumsmedien (50 % TSB und 50 % PDB) verwendet wurden60. Diese Mikroorganismen wurden bei –70 °C in 20 % Glycerin gelagert. Die Temperatur für die Saatkulturvorbereitung und Subkultivierung der Mikroorganismen auf einer Agarplatte betrug 37 °C.

Ergänzende Abbildung S1 zeigt das Design des Mikrofluidikgeräts und den Versuchsaufbau für das Biofilmwachstum. Drei unabhängige Kanäle auf einer Plattform (Abstand zwischen zwei Kanälen = 7 mm) wurden entworfen, um gleichzeitig die verschiedenen hydrodynamischen Bedingungen (dh drei Durchflussraten) zu analysieren. Jeder Kanal verfügt über zwei Einlässe für Mikroorganismen und Mediumversorgung sowie einen Auslass für die Abfallsammlung (siehe ergänzende Abbildung S1a, b). Jeder beobachtete Kanal hatte eine Breite von 100 µm und eine Höhe von 180 µm (siehe ergänzende Abbildung S1a). Der maßgeschneiderte mikrofluidische Chip aus Polydimethylsiloxan wurde mit dem SolidWorks-Programm (Dassault Systèmes SolidWorks Co., Frankreich) entworfen. Eine Photoresistform (PR) für den Mikromischer wurde durch zweistufige Photolithographie unter Verwendung eines negativen PR (SU-2050, MicroChem Corp, USA) hergestellt. Das PR für die erste Kanalschicht wurde 15 s lang bei 500 U/min und 40 s lang bei 1500 U/min auf einen Siliziumwafer aufgeschleudert. Die gleiche Schleuderbeschichtung wurde wiederholt, um die zweite Gratschicht nach PR-Einbrennen und UV-Belichtung zu definieren. Diese Spinnbedingungen führten zu einer Kanalhöhe von 160–165 μm und einer Grathöhe von 55–80 μm. Der Chip wurde auf einem 76 mm × 26 mm großen Glasobjektträger konstruiert (siehe ergänzende Abbildung S1c). In der anfänglichen Injektionsphase von Mikroorganismen und Medium wurde ein Fischgrätenmischer auf dem Mikrofluidikchip aufgebaut, um die Mikroorganismen und das Medium zu mischen, bevor sie in die beobachteten Kanäle eingeimpft wurden61. Tygon-Röhren (Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Frankreich) wurden verwendet, um die mikrofluidischen Einlässe mit den Infusionspumpen (New Era Pump Systems, Inc., USA) zu verbinden. Um die Mischfähigkeit des hergestellten Chips zu bewerten, wurden zweifarbige Pigmente (blau = Erioglaucin-Dinatriumsalz; gelb = Tartrazin) eingesetzt und durch Messung des Grauwerts bewertet.

Die Biofilmbildung (S. aureus und C. albicans) im Mikrofluidikkanal erfolgte nach einem beschriebenen Verfahren mit einer leichten Modifikation36. Die über Nacht gezüchteten S. aureus (gezüchtet in TSB) und C. albicans (gezüchtet in Kartoffel-Dextrose-Brühe mit 5 % Glucose) wurden in ihren jeweiligen Wachstumsmedien verdünnt (1:100, entsprechend einem OD600-Wert von 0,05). Um eine Kontamination zu vermeiden, wurde die Mikrofluidikplattform zweimal mit 70 % Ethylalkohol und erneut mit einem sterilen Wachstumsmedium gewaschen. Um einen Monospezies-Biofilm zu etablieren, wurde die verdünnte Mikroorganismenkultur, die in ihren jeweiligen Wachstumsmedien hergestellt wurde, vollständig in den Mikrofluidikkanal injiziert und 2 Stunden lang ruhen gelassen, um sich an der Innenfläche des Kanals anzuheften (Abb. 8a). Andererseits wurde für die Etablierung eines Dual-Spezies-Biofilms aus S. aureus und C. albicans ein gleiches Volumen der verdünnten Zellkultur des Mikroorganismus (hergestellt in ihren jeweiligen Wachstumsmedien) mithilfe von Infusionspumpen in den Mikrofluidikkanal gepumpt ( NE-1000, New Era Pump Systems, Inc., NY, USA). Die Auslässe wurden manuell verschlossen, um aufgrund des angesammelten hohen Drucks die restlichen Luftblasen vollständig aus den Kanälen zu entfernen. An den Eingängen jedes Kanals wurden zwei Luftfallen angebracht, um die Bildung von Luftblasen in den Kanälen zu verhindern, wenn die frische Kultur/das frische Medium während der Experimente gewechselt wurde. Die hydrodynamischen Bedingungen wurden mit Infusionspumpen für weitere 24 Stunden Inkubation kontrolliert (Abb. 8a). Basierend auf dem vorherigen Bericht wurden die drei Flussraten auf 0,5, 1,0 und 1,5 µL/min eingestellt (Flussgeschwindigkeit = 27,8, 55,6 bzw. 83,4 mm/min)62,63. Ein inverses Mikroskop (CKX-53, Olympus, USA) wurde verwendet, um die Prozesse der mikrobiellen Anhaftung, Biofilmbildung und optischen Behandlung in Echtzeit visuell zu überwachen. Die Biofilmbildung wurde alle 2 Stunden analysiert und aufgezeichnet. Alle Experimente wurden bei 25 °C (Raumtemperatur) durchgeführt. Abbildung 8b zeigt S. aureus-Bakterien (links), C. albicans (Mitte) und gemischte (rechts) Biofilme, die auf den aktuellen Mikrofluidikkanälen gebildet wurden.

Versuchsaufbau der opto-mikrofluidischen Plattform für die Biofilmkultur und -behandlung: (a) Versuchsaufbau und (b) S. aureus-Biofilm (links), C. albicans-Biofilm (Mitte) und Dual-Spezies-Biofilm (S. aureus + C . albicans; rechts) (IM-Umkehrmikroskop, L1–L2-Linsen, OD-Optikdiffusor, BS-Strahlteiler, PC-Personalcomputer; Maßstabsleiste = 25 µm).

Die Reynolds-Zahl (Re) ist ein wichtiger dimensionsloser Parameter in viskosen Strömungen, insbesondere bei Vorhandensein verschiedener Längenskalen. Um eine gut charakterisierte mikrofluidische Plattform zu entwerfen, wird normalerweise empfohlen, dass die Strömung Re < 100 hat, um laminare Strömungen in den Kanälen sicherzustellen. Re kann durch64 ausgedrückt werden

wobei \(\rho\), D und μ die Dichte des Mediums (1000 kg/m3), der hydraulische Durchmesser des Kanals (100 μm), die Strömungsgeschwindigkeit des Mediums auf den Kanälen (27,8, 55,6, und 83,4 mm/min für Durchflussraten von 0,5, 1,0 bzw. 1,5 µL/min) und dynamische Viskosität des Mediums (0,89 mPa)65.

Die Scherspannung auf dem Mikrokanalboden wurde von64 berechnet

Dabei sind Q, w und h der Volumenstrom (μm3/s), die Kanalbreite (180 μm) bzw. die Kanalhöhe (100 μm).

Zur Erstellung eines Raytracing-Modells wurde die kostenlose Online-Software 3DOPTIX (3DOptix Co., Tel Aviv, Israel) verwendet. Eine 405-nm-Lichtquelle (CNI Co., Changchun, China) wurde verwendet, um die antimikrobielle Wirkung von Laserlicht auf reife Mono- und Dual-Spezies-Biofilme zu analysieren (Abb. 8). Zur Kollimation des einfallenden Laserstrahls wurden zwei Linsen verwendet (eine asphärische Linse mit einer effektiven Brennweite von 25 mm und eine plankonvexe Linse mit einem EFL von 6 mm; Edmund Optics Co., City, State, USA). Ein optischer Diffusor (Edmund Optics Co., City, State, USA) wurde verwendet, um den kollimierten Gaußschen Strahl umzuformen, um räumlich gleichmäßige Emissionen auf mikrofluidische Kanäle anzuwenden. Dieser Ansatz ermöglichte es der Mikrofluidikplattform, sich frei zu bewegen und gleichzeitig eine konstante Intensität des Laserlichts auf den Kanälen aufrechtzuerhalten. Um die effektive Dosis des 405-nm-Laserlichts auf den mikrobiellen Biofilmen zu bestimmen, wurden drei Strahlteiler (Verhältnis = 50:50; Edmund Optics Co., USA) zur Abgabe an die Mikrofluidikkanäle verwendet. Das auf die beobachteten Kanäle abgegebene Laserlicht wurde mit abnehmenden Dosen, wie 50 %, 25 % und 12,5 %, 90 Minuten lang mit Laserbestrahlungsstärken von 0,2, 0,1 und 0,05 W/cm2 und Laserfluenzen von 1080, 540, bzw. 270 J/cm2. Nach jeweils 10 Minuten wurde die Wirkung der Laserbehandlung gegen Mono- und Dual-Spezies-Biofilme aufgezeichnet.

Mikrofluidische Kanäle wurden in Echtzeit mit einem Umkehrmikroskop (CKX-53, Olympus, USA) mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung (Hellfeld- und Phasenkontrast) und einer Digitalkamera (Nikon D3500 DSLR, Nikon Inc., USA). Um die Biofilmbedeckung zu bestimmen, wurden die etablierten sichtbaren Biofilme auf dem Kanalboden der Mikrofluidikplattform (Bodenfläche ~ 130 × 100 µm2) an drei zufälligen Stellen (für jede Messung N = 3) mit dem Mikroskop erfasst. Alle erfassten mikroskopischen Bilder wurden dann in 8-Bit-Formate umgewandelt und mithilfe der Software Fiji (National Institutes of Health, Bethesda, MD) verarbeitet. Die Biofilmbedeckung wurde dann als Prozentsatz (%) der gemessenen Biofilmfläche zur erfassten Fläche dargestellt. Das TrackMate-Plugin wurde verwendet, um die Einzelzellbewegung der frühen Biofilmbildung 12 Stunden lang auf einer Teilmenge des FOV66 zu verfolgen. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit SYTO-9 und Propidiumiodid-Farbstoffen durchgeführt, um lebende (mit grüner Farbe gefärbt) und tote (mit roter Farbe gefärbte) Zellen sichtbar zu machen67.

Um die Biofilmbildung im Mikrofluidikgerät mit statischen Bedingungen (ohne Schütteln bei 25 °C) zu vergleichen, wurden die über Nacht gewachsenen Zellkulturen von S. aureus und C. albicans in ihren jeweiligen Wachstumsmedien mit einer normalisierten OD600 von 0,05 verdünnt. Für die Monospezies-Biofilmtests wurde die verdünnte Zellkultur im Wachstumsmedium in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geimpft und 24 Stunden lang inkubiert. In ähnlicher Weise wurden für die Dual-Spezies-Biofilmtests gleiche Volumina verdünnter (OD600 = 0,05) Kulturen von S. aureus und C. albicans in die Mikrotiterplatte inokuliert und 24 Stunden lang inkubiert. Nachdem die frei schwebenden Zellen verworfen worden waren, wurden die oberflächengebundenen Zellen mit Wasser gewaschen und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Die gefärbte Zellkultur wurde in 95 % Ethylalkohol gelöst und bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (BioTek, Winooski, VT, USA) quantifiziert.

Sowohl Mono- als auch Dual-Spezies-Biofilmarchitekturen, die unter statischen Bedingungen entstanden sind, wurden mittels REM (TESCAN; Vega II LSU, Tschechisch) visualisiert. Mono- und Dual-Spezies-Biofilme wurden auf der Oberfläche einer Nylonmembran (0,5 × 0,5 cm) gezüchtet und in eine Mikroplatte mit 24 Vertiefungen gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 25 °C wurde die Zellkultur über Nacht bei 4 °C direkt mit Formaldehyd und Glutaraldehyd fixiert. Die fixierten Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4) gewaschen und anschließend mit steigenden Konzentrationen (50–100 %) Ethylalkohol dehydriert. Zum Trocknen der Membran wurde ein Gefriertrockner (FD8518, ilShinBiobase Co. Ltd., Korea) verwendet. Die Biofilmarchitektur der Nylonmembran wurde mithilfe eines Elektronenmikroskops sichtbar gemacht.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Jede Gruppe (sowohl behandelte als auch unbehandelte Kontrollproben) wurde fünfmal gemessen (N = 5). Aufgrund der geringen Anzahl an Testproben und verteilungsfreien Daten wurde der Mann-Whitney-U-Test für eine nichtparametrische statistische Analyse verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu bewerten46. Eine Bonferroni-Korrektur mit einem angepassten p-Wert wurde als Post-hoc-Test verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer fälschlichen Ablehnung der Nullhypothese beim Vergleich jedes Gruppenpaars zu minimieren67,68. Zur Unterstützung des Berechnungsprozesses wurde ein SPSS-Programm (SPSS, Inc., Chicago, USA) verwendet, und p < 0,5 wurde als statistisch signifikant angesehen69.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch das von der koreanischen Regierung finanzierte Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) (MSIT) (Nr. 2021R1A2C2003733) und das vom Bildungsministerium finanzierte Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt ( Nr. 2021R1A6A1A03039211).

Die folgenden Autoren trugen gleichermaßen bei: Van Nam Tran, Fazlurrahman Khan und Won Han.

Industrie 4.0 Convergence Bionics Engineering and Marine-Integrated Biomedical Technology Center, Pukyong National University, Busan, 48513, Südkorea

Van Nam Tran, Maknuna Luluil, Van Gia Truong, Joong Ho Shin und Hyun Wook Kang

Forschungszentrum für Marine Integrated Bionics Technology, Pukyong National University, Busan, 48513, Südkorea

Fazlurrahman Khan, Young-Mog Kim und Hyun Wook Kang

Abteilung für Biomedizintechnik, Pukyong National University, Busan, 48513, Südkorea

Won Han, Joong Ho Shin und Hyun Wook Kang

Abteilung für Elektrotechnik, Hanyang-Universität, Seoul, 04763, Südkorea

Hyo Geun Yun & Sungyoung Choi

Abteilung für Biomedizintechnik, Hanyang-Universität, Seoul, 04763, Südkorea

Sungyoung Choi

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und -technologie, Pukyong National University, Busan, 48513, Südkorea

Young-Mog Kim

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VNT, FK und WH konzipierten, gestalteten und führten die Experimente durch, analysierten, erstellten die Figuren und verfassten das Manuskript. ML führte eine Bildverarbeitung durch. VGT führte die Experimente durch. YMK, JHS und HWK konzipierten und überwachten die Studie, überarbeiteten das Manuskript und genehmigten die endgültige Fassung. Alle Autoren haben zum kritischen Verfassen des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Joong Ho Shin oder Hyun Wook Kang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tran, VN, Khan, F., Han, W. et al. Echtzeitüberwachung der Bildung und Beseitigung von Mono- und Dual-Spezies-Biofilmen mithilfe einer mikrofluidischen Plattform. Sci Rep 12, 9678 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13699-9

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Eingegangen: 10. Dezember 2021

Angenommen: 26. Mai 2022

Veröffentlicht: 11. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13699-9

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